Penggunaan Media Alternatif dalam Kultur In Vitro Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl.)

Ringkasan : Paula Sara. E33101076. Penggunaan Media Alternatif dalam Kultur In Vitro Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl.) Dibawah Bimbingan Ir. Edhi Sandra, M.Si.

Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl.) merupakan tumbuhan perdu yang berasal dari Papua Nugini. Tinggi mencapai 1-2.5 m Tumbuh baik di ketinggian 100 – 1.200 mdpl. Berbunga pada April – Agustus. Buah merah marun. Berkat sosoknya yang baik maka banyak digunakan sebagai tanaman hias. Meskipun beracun tetapi jika diolah secara benar maka fungsinya dapat di jadikan sebagai obat berbagai macam penyakit.

Oleh sebab itulah banyak orang yang mencari untuk dikonsumsi sebagai obat. Karena permintaan yang semakin tinggi maka dikhawatirkan kelestarian dari tanaman ini akan terancam, tetapi mengingat khasiatnya banyak dibutuhkan orang maka dengan teknik pengembangbiakan secara kultur in vitro diharapkan mampu menyelesaikan kedua permasalahan tersebut.

Kajian tentang kultur in vitro harus semakin ditingkatkan mengingat keterbatasan modal yang harus dikeluarkan pada usaha tersebut, maka dengan penyediaan media Alternatif diharapkan mampu membantu dalam peningkatan pelestarian plasma nutfah, dan mampu melayani permintaan pasar serta mengurangi input dana yang dikeluarkan bagi usaha kultur in vitro.

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Kultur Jaringan di Cimanggu Bogor. Penelitian ini dilaksanakan selama 2 bulan dari bulan Februari – April 2004.

Penelitian ini dilakukan dengan 2 kali percobaan, yaitu pertama dengan percobaan pendahuluan, dengan menanam eksplan biji pada media MS-BAP 0.05% dengan maksud dapat menghasilkan tunas yang baru yang dapat dijadikan eksplan, percobaan kedua yaitu dengan pembuatan media alternatif yang terdiri dari Hyponex Hijau 1gr, Vitamin B1 1ml, M-Dext 2ml, Mikroplus 1ml, Norid 0,5gr Gula 30gr, Tepung Tapioka 80gr.

Bahan eksplan yang ditanam yaitu dengan biji yang diambil langsung dari alam serta sub kultur pucuk dengan dua perlakuan.

Penggunaan media Alternatif didasarkan pada kandungan hara makro dan mikro yang terkandung didalam Hyponex Hijau dan ditambah penyehat tanaman M-Dext dan Mikroplus. Sedangkan ZPT terdapat dalam Vitamin B1 yang mengandung NAA. Norid sebagai arang aktif yang membantu pertumbuhan akar dengan memberi efek gelap pada media dengan pemadat Tapioka yang juga dapat memadatkan jika dengan pemanasan yang tepat, yaitu 90 ⁰ C.

Media Alternatif lebih murah dan mudah didapat dan dapat menggantikan media lain misalnya MS yang tergolong mahal sehingga membutuhkan input dana yang besar jika menggunakannya. Media MS-0 kurang lebih membutuhkan dana sebesar Rp. 15.0000 perliter pembuatan media, sedangkan media laternatif hanya membutuhkan dana Rp 348 per liter pembuatan media.

Perlakuan I yaitu dengan sub kultur dari media MS-BAP ke media Alternatif, dan Perlakuan II yaitu sub kultur dari media Alternatif ke Media Alternatif. Parameter yang diamati adalah akar, tunas jumlah daun, dan kontaminasi. Hasil pada dua perlakuan menunjukan dari tingkat kontaminasi perlakuan II lebih baik yaitu dengan nilai P < 0.01 yang berarti sangat berbeda nyata. Hasil P sebesar 0.008. Perlakuan terhadap biji eksplan biji hanya dengan dua kali ulanga. Hal ini dikarenakan lebih memprioritaskan sub kultur dengan tujuan mendapatkan hasil kultur yang lebih baik yaitu dengan pemilihan jenis yang baik akan menghasilkan hasil kultur yang baik pula. Dari hasil yang didapatkan diketahui bahwa dengan media Alternatif dapat dijadikan media tumbuh bagi ekplan biji Mahkota Dewa sedangkan untuk sub kultur juga dapat tumbuh jika multiplikasi dilakukan dari media Alternatif ke Media Alternatif

Media Kultur Jaringan

Komponen Media Kultur Jaringan

Garam garam Anorganik
Setiap tanaman paling sedikit membutuhkan 16 unsur untuk tumbuh normal. Unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar disebut unsur makro, unsur yang sedikit dibutuhkan disebut unsur mikro. Yang termasuk unsur makro adalah Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Sulfur(S), Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg). Unsur NPK mutlak diperlukan , sedangkan unsur S, Ca, Mg boleh ada atau tidak , tetapi karena fungsinya sangat mendukung pertumbuhan jaringan maka akan lebih baik apabila unsur-unsur tersedia.

Vitamin
Vitamin-vitamin yang sering digunakkan dalam media kultur jaringan antara lain adalah tiamin (vitamin B1), Piridoksin (Vit B6) dan asam nikotinat.

Vitamin-vitamin ini umumnya terdapat didalam tanaman. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dan karbohidrat dan memindahkan energi, asam nikotinat penting dalam reaksi reaksi enzimatik, disamping berperan sebagai prekusor dari beberapa alkaloid, pemberian vit C bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan.

Vitamin lain yang sering ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah : Niasin, glisin, Myo-inositol, asam folat, sianokabalamin, riboflavin, biotin, kolin klorida, kalsium pantetonat, piridoksin pospat.

Gula
Sukrosa yang sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus. Sukrosa dengan konsentrasi 2%-5% merupakan sumber karbon, penggunaan sukrosa diatas 3% menyebabkan terjadinya penebalan dinding sel. Pengaruh rangsangan dari gula untuk pertumbuhan ditentukan juga dengan cara sterilisasinya. Penggunaan autoklav untuk sterilisasi dapat memberikan pengaruh baik atau buruk terhadap pertunbuhan tergantung gula yang digunakan dalam medium tersebut.

Glukosa dan fruktosa dapat digunakan untuk mengganti sukrosa karena dapat merangsang pertumbuhan beberapa jaringan. Pemilihan gula dan konsentrasi yang akan digunakan tergantung dari jaringan tumbuhan yang akan dikulturkan dan tujuan yang ingin dicapai.


Asam amino dan N organik
Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-beda. Aspargin dan glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena dapat menjadi pembawa dan sumber ammonia untuk sintesis asam-asam amino baru dalam jaringan.

Zat Pengatur Tumbuh
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdiri dari lima kelompok yaitu auksin, giberelin, sitokinin, etilen dan inhibitor dengan cirri khas serta pengaruh yang berlainan terhadap fisiologis

Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa zat pengatur tumbuh dalam medium pertumbuhan terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh . Pertumbuhan kalus dan organ-organ ditentukan oleh penggunaan yang tepat dari zat pengatur tumbuh tersebut

Persenyawaan kompleks alamiah
Contohnya adalah air kelapa, ekstrak ragi, juice tomat, ekstrak kentang dsb.
Bahan yang terkandung dalam air kelapa antara lain asam amino, asam-asam organik, asam nukleat, purin, gula, gula alcohol, vitamin, mineral dan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh dalam air kelapa 9-b-d ribofuranosyl zeatin, zeatin, n-n`-diphenyl urea.

Campuran Casein hiydrolisat dan ekstrak ragi merupakan sumber asam amino yang ditambahkan untuk memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis terutama media yang tidak mengandung ion ammonium.

Bahan Pemadat
Bahan pemadat yang sering digunakan adalah agar, keuntungan pemakaian agar adalah: agar membeku pada temperatur .. 45C dan mencair pada temperatur 100C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil, tidak dicerna enzim tanaman, dan tidak beraksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media. Kandungan agar sedikit mengandung unsure Ca, Mg, K dan Na.

Kekerasan media meningkat secara linear pada pertambahan konsentrasi agar, kekerasan media juga dipengaruhi oleh jenis agar yang dipakai, pH media, dan penambahan arang aktif


Arang aktif
Arang aktif adalah arang yang sudah dipanaskan selama beberapa jam dengan menggunakkan uap atau udara panas. Bahan ini mempunyai daya adsorpsi yang sangat kuat.

Pengaruh penambahan arang aktif pada media dapat mengadsorpsi persenyawaan persenyawaan toxic yang dapat menghambat pertumbuhan kultur terutama persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka pada waktu inisiasi,dapat mengadsorpsi zat pengatur tumbuh sehingga mencegah pertumbuhan kalus yang tidak diinginkan dan merangsang perakaran dengan mengurangi tingkat cahaya sampai kebagian eksplan yang terdapat dalam media.

Arang aktif yang ditambahkan diusahakan merata dalam media, dengan cara dikocok setelah sterilisasi dalam autoclave sebelum membeku.

Buffer atau pH media
PH harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membram sel dan pH dari sitoplasma. Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar 5,5-5,8.

Pengaturan pH biasanya dilakukan dengan menggunakkan NaOH (KOH) atau HCl pada waktu semua komponen telah dicampur, beberapa saat sebelumdisterilkan dalam autoclave. Penambahan asam amino seringkali sebagai buffer organik.


Bentuk fisik Media Kultur
Media tanam Kultur jaringan dapat terdiri dari media cair dan media padat. Media cair adalah media tanpa bahan pemadat agar

Macam Macam Media Kultur
Pada umumnya media kultur jaringan dapat dibedakan menjadi media dasar dan perlakuan. Media dasar mengandung hara esensial makro dan mikro, sumber energi dan vitamin.

Penamaan media dasar umumnya diambil dari peneliti yang pertama kali menggunakannya. Beberapa media dasar yang banyak digunakan adalah Media Murashige dan Skoog (1962), media White (1934) untuk kultur akar, media Nitsch dan Nitsch untuk kultur pollen, media Vacin and Went untuk kultur jaringan anggrek.

Pembuatan Larutan Stok
Pembuatan larutan stok merupakan langkah awal pembuatan media yang dipilih. Pembuatan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media.

Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokkan dalam : stok makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormon. Stok hormon dapat disimpan antara 2-4 minggu sedangkan stok hara 4-8 minggu.

Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.

Stok hara makro
Senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar. Oleh karena itu dibuat dalam stok larutan tunggal selain itu jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama, kemungkinan hal tersebut akan mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan stok tunggal.

Stok hara mikro
Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media. biasanya larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 200kali konsentrasi akhir media dan bahan yang diperlukan masih cukup kecil jumlahnya. Oleh karena itu larutan stok unsur hara mikro dapat dibuat sebagai stok campuran.

Larutan stok vitamin
Bila vitamin bukan merupakan perlakuan artinya semua media menggunakkan konsentrasi vitamin yang sama, maka larutan stok vitamin dapat dibuat stok campuran

Larutan stok zat pengatur tumbuh
Zat pengatur tumbuh umumnya hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit. Proses penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok sulit digeneralisasikan, karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan.

Pembuatan Media Kultur Jaringan dari Pisang

Media Vacin and Went lainnya yang telah dimodifikasi

Pengalaman beberapa growers dengan media pisang sebagai tambahan pada media KNUDSON atau media Vacin and Went, telah diketahui. Meskipun demikian masih perlu diketahui bagaimana cara memakainya pisang tersebut atau cara mengolahnya, sehingga media siap dipakai untuk menanam jaringan atau menyebar biji anggrek.

Di Hawaii bahan pisang yang dipergunakan adalah green banana atau kalau di Indonesia lebih dikenal dengan nama pisang ambon. Indonesia mempunyai bermacam-macam pisang, maka perlu sekali ada penelitian khusus, pisang apakah sebenarnya yang paling bagus untuk menanam jaringan atau tissue culture dan untuk menabur biji.


1. Pemakaian pisang ambon masak untuk media.

Cara umum yang dipakai yaitu mengambil 150 – 200 gram pisang ambon yang telah masak kemudian dilumatkan dengan blender dan di masukan ke dalam media Vacin and Went. Blender adalah alat yang biasa dipakai untuk melumatkan buah, menjadi sari buah.

2. Pemakaian pisang ambon masak yang diiris-iris.

Media ini yang membuat JAMADA. Pisang ambon yang telah masak diiris-iris seperti uang logam setebal lebih kurang 3 mm dan di letakan pada dasar alas makanan. Erlenmeyer dengan volume 250 cc diberi 3 sampai 5 potong pisang ambon. Yang paling meng herankan ialah waktu seedlings keluar akar nya, akar-akar yang panjang semua menancap masuk dalam lempengan-lempengan pisang ambon, sehingga memberi kesan seolah-olah tanaman anggrek sungguh-sungguh lebih senang pisang ambon dari pada media agarnya sendiri.

3. Pemakaian pisang ambon mentah untuk media

SAGAWA di laboratorium Departement of Hprticulture, University of Hawaii memper gunakan pisang ambon yang masih mentah yang diblender, tidak heran kalau medianya agak berwarna kehitam-hitaman seperti warna getahnya. Menurut SAGAWA buah pisang ambon yang mentah ini lebih baik daripada yang telah masak.

Pembuatan media kultur jaringan Anggrek dari Air Kelapa

Cara pembuatan media Vacin and Went yang telah dimodifikasi
Media Vacin and Went adalah media kultur jaringan yang baik untuk tissue culture anggrek., yang dibuat menggunakan air kelapa. Dibawah ini tertera resep Vacin and Went yang telah diperbaiki atau modified :

Tricalsium-phosphat	Ca3(PO4)2	0,20 gram
Potasium nitrat	KNO3	0,525 gram
Mono-potasium-phosphat	KH2PO4	0,25 gram
Magnesium-sulfat	MgSO4. 7H2O	0,25 gram
Ammonium-sulfat	(NH4)2SO4	0,50 gram
Ferri-tartrat	(Amend Drug chemical Co, N.Y)	0,028 gram
Mangan-sulfat	MnSO4.2H2O	0,0075 gram
Saccharose	Gula	20,0 gram
Agar	-	8,0 gram
Air	-	850 cc
Air kelapa	-	150 cc

Hal-hal yang harus diperhatikan :
Meskipun resep sudah tertulis di atas, tetapi ada liku-liku kecil yang perlu diperhatikan, sehingga alas makanan menjadi lebih baik, dapat menumbuhkan jaringan dengan suburnya.

1. Ferri tartrat.
Ferri tartrat perlu untuk campuran buffer, untuk pH 4,8 – 5,0. buffer ini penting, apalagi ada Ferrinya dalam media atau alas makanan ini. Ferri tartrat dapat larut antara pH tersebut di atas dan diambil tanaman dengan baiknya, akibatnya tanaman tumbuh dengan subur.
Perubahan pH menjadi lebih tinggi, Ferrinya akan mengendap, tanaman tidak akan dapat menyerap Ferri karena Ferri tidak larut lagi, akibatnya pertumbuhan jaringan atau pertumbuhan tanaman akan mundur. Ferri tartrat perlu dipersiapkan sendiri yaitu dengan pemanasan 0,028 gram Ferri tartrat dalam 250 cc aquadest, kemudian dipanasi atau dimasukkan dalam oven. Pemanasan agak lama sampai semua kristal larut, warna menjadi kuning tua kehijauan.

2. Mempersiapkan calcium-phosphat.
Larutkan 0,20 gram calcium-phosphat, Ca3(PO4)2. Calcium-phosphat sukar larut, cara melarutkan dengan jalan memasukan calcium-phosphat ke dalam beberapa cc HCl-IN dan dipanasi sampai semua larut, tidak ada kristal yang masih terlihat lagi, pemanasan cukup lama. Jika calcium- phosphat tidak larut bararti alas makanan kurang baik, sebab bagian phosphat tidak larut dan tidak mudah di serap jaringan.

3. Mempersiapkan garam-garam lain.
Dalam mempersiapkan garam-garam lain di kerjakan tindakan-tindakan sebagai berikut :
Ambil :
Air 850 cc
KNO3 0,525 gram
KH2PO4 0,25 gram
MgSO4.7H2O 0,25 gram
(NH4)2SO4 0,50 gram
MnSO4.2H2O 0,0075 gram

4. Tambahkan larutan Ferri tartrat pada larutan yang berisi garam-garam tersebut pada no. 3 di atas.
5. Setelah itu ditambahkan larutan-larutan calcium-phosphat pada larutan no. 4
6. Tambahkan kemudian 150 cc air kelapa

Sebelumnya, air kelapa dipersiapkan terlebih dahulu.
Pertama-tama dilakukan pemilihan terhadap buah kelapa. Kelapa yang baik adalah kelapa yang airnya manis sekali. Mengenai tua mudanya kelapa, pilihlah kelapa yang daging nya masih lunak, masih mudah disendok, tetapi sudah berwarna putih santan. Dalam bahasa Jawanya dikatakan kemerut buntut.
Air kelapa disaring 2 kali dengan kertas saring, kemudian diambil 150 cc dan di tambahkan pada campuran larutan no. 5.
Bagi yang mempenyai freezer. Kecuali tiap kali membutuhkan, air kelapa selalu tersedia, juga effeknya terhadap pertumbuhan tanaman, lebih baik.
7. Kemudian tambahakan saccharose 20,0 gram
8. Air ditambahkan pada campuran larutan di atas sampai menjadi 1000 cc. Bagi yang mempunyai labu takar atau gelas ukur yang bervolume 1000 cc, air ditambahkan sampai batas atau tanda garis pada labu takar atau gelas ukur.
9. Setelah itu pH dibuat menjadi 4,8 – 5,0 dicek dengan pH meter atau menggunakan indikator Bromo-cresol-green, yang dapat minta dibuatkan di apotik dan dapat ditanyakan bagaimana cara kerjanya.
10. Tambahkan agar 8 gram per liter atau menurut selera kepadatan yang dikehendaki untuk media padat atau media tanpa agar untuk media cair.
11. Campuran larutan di atas kemudian dipanaskan pelan-pelan sampai semua agar larut semua.
12. Masukan media atau alas makanan dalam botol-botol.
13. Media tersebut telah siap untuk disterilisasi. Setelah disterilkan media dapat dipakai untuk menanam jaringan atau menabur biji-biji anggrek.

Cara Membuat Media Tanam Kultur Jaringan dari bahan organik

Cara membuat media kultur jaringan yang praktis adalah dengan menggunakan,

Murashige dan Skooge (MS) Praktis
a. Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml
b. Timbang media MS sebanyak 4,43 gram/liter
c. Timbang gula pasir sebanyak 30 gram/liter, kecuali untuk anggrek 20 gram /liter
d. Timbang agar sebanyak 7-8 gram/liter
e. Masukan media (MS), gula pasir, agar ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
f. Masak media hingga mendidih
g. Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan
• Untuk botol kecil sebanyak 10 ml
• Untuk botol selai sebanyak 20 ml
• Untuk botol saus sebanyak 35 ml
h. Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
i. Media siap disterilisasi di dalam autoklaf

Media Alternatif: Hyponex/Gandasil D atau vitabloom D
a. Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml
b. Timbang hiponex 2 gram/liter
c. Timbang gula pasir 20 gram/liter
d. Timbang agar 7-8 gram/liter
e. Masukkan hiponex, gula, agar ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
f. Masak media hingga mendidih
g. Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan
• Untuk botol kecil sebanyak 10 ml
• Untuk botol selai sebanyak 20 ml
• Untuk botol saus sebanyak 35 ml
h. Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
i. Media siap disterilisasi di dalam autoklaf

Selain itu kita dapat membuat sendiri media tanam untuk kultur jaringan, dengan bahan organik yang ada disekitar kita seperti kentang, ubi, pisang, tomat, air kelapa dan lain-lain

Menggunakan media organik : kentang atau ubi untuk kultur jaringan anggrek
a. Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml
b. Siapkan air kelapa muda sebanyak 150 ml/liter
c. Timbang 500 gram kentang, kupas, cuci, potong
d. Rebus kentang ke dalam 1,5 liter air hingga menyusut 300 ml
e. Saring air rebusan kentang
f. Timbang gula pasir 20 gram/liter
g. Timbang agar 7-8 gram/liter
h. Timbang arang aktif 0,5 gram/liter
j. Masukkan air rebusan kentang, gula, agar, arang aktif, air kelapa ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
k. Masak media hingga mendidih
l. Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan
• Untuk botol kecil sebanyak 10 ml
• Untuk botol selai sebanyak 20 ml
• Untuk botol saus sebanyak 35 ml
m. Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
i. Media siap disterilisasi di dalam autoklaf

Menggunakan Tomat/Pisang raja/Pisang ambon
a. Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml
b. Siapkan air kelapa muda sebanyak 150 ml/liter
c. Timbang 300 gram tomat, potong, buang isinya, ambil daging buahnya
d. Blender daging tomat, saring, ambil airnya.
e. Timbang gula pasir 20 gram/liter
f. Timbang agar 7-8 gram/liter
g. Timbang arang aktif 0,5 gram/liter
h. Masukkan air rebusan kentang, gula, agar, arang aktif, air kelapa ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
i. Masak media hingga mendidih
j. Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan
• Untuk botol kecil sebanyak 10 ml
• Untuk botol selai sebanyak 20 ml
• Untuk botol saus sebanyak 35 ml
k. Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
l. Media siap disterilisasi di dalam autoklaf

Cara Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Jaringan

Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, - Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Media dan Aquades
Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.

Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm. Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan antibiotik: carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.

Enkas
Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan. Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan enkas.

Laminar
Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,

"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.