STERIL ADALAH FAKTOR TERPENTING DALAM LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

Oleh: Ir. Edhi Sandra MSi

1. Kepala LaboratoriumKultur Jaringan Bagian Konservasi Tumbuhan Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata Fakultas Kehutanan IPB Bogor.

2. Kepala Laboratorium Bioteknologi Lingkungan PPLH IPB Bogor

3. Pemilik Esha Flora Plant And Tissue Culture Bogor

(foto dari Google: shuye3.wordpress.com)

Pendahuluan

Banyak orang salah di dalam menentukan prioritas faktor yang mempengaruhi kualitas laboratorium kultur jaringan. Demikian pula dengan menganalisa faktor tersebut masih salah persepsi sehingga dalam pelaksanaannya faktor tersebut tidak tepat sasaran sehingga tidak bermanfaat optimal terhadap tujuan yang diinginkan.

Persepsi Kurang Tepat Tentang Laboratorium Kultur Jaringan

Laboratorium kultur jaringan dipersepsikan sebagai ruang yang tertutup, ber AC dan banyak lampunya. Hal inilah yang dijadikan acuan di dalam membuat lab kultur jaringan. Padahal tidak tepat seperti itu yang seharusnya.

Ruang Tertutup

Di dalam laboratorium kultur jaringan bukan ruang tertutupnya yang menjadi acuan, tetapi terisolasinya suatu ruangan dari kontaminasi mikroba. Jadi maksudnya ruangan tertutup tidak menjamin ruangan tersebut otomatis menjadi steril. Dan yang terpenting adalah ”sterilnya” bukan ”tertutupnya”. Berarti dalam hal ini yang sebenarnya adalah ruang laboratorium kultur jaringan harus steril dan tetap selalu dijaga agar tetap steril sepanjang waktu. Bagaimana membuat steril ruang kultur jaringan dan menjaganya agar tetap steril sepanjang waktu, itulah yang penting diperhatikan.

Ruang Steril

Definisi ruang steril dalam lab kultur jaringan adalah suatu ruangan yang kedap (terisolasi dari luar), yang kemudian disterilkan. Sterilisasi ruang laboratorium kultur jaringan dapat dilakukan dengan cara mentserilkannya dengan formalin yang diuapkan, alkohol dengan cara disemprotkan atau dengan menggunakan lampu UV atau dengan AC Plasma clastur (AC yang dapat membunuh kuman).

Menjaga ke”sterilan” laboratorium kultur jaringan seringkali dilupakan atau pemahaman mengenai steril bagi sebagian masyarakat masih disamakan dengan bersih. Padahal bersih belum tentu steril. Menjaga ruangan laboratorium kultur jaringan agar tetap steril memerlukan perawatan yang rutin yang bersifat harian, mingguan, smesteran dan tahunan. Semua hal yang dapat mengurangi dan menghambat masuknya mikroba ke dalam laboratorium kultur jaringan dapat kita lakukan, diantaranya:

1. Menjaga agar ruangan selalu dalam kondisi kedap (terisolasi dari luar). Masuknya udara luar biasanya pada kondisi laboratorium kultur jaringan konvensional terjadi pada saat pintu laboratorium dibuka maka udara luar ikut masuk yang akan membawa mikroba yang akan menyebabkan kontaminasi Oleh sebab itulah sebaiknya ada ruangan kecil yang berperan sebagai antara, yang di ruangan tersebut digunakan untuk menyedot debu yang ada saat orang tersebut berada diruangan tersebut dan dilakukan sterilisasi dengan menyemprotkan uap alkohol yang tidak membahayakan manusianya.

2. Masuknya orang ke dalam ruang laboratorium pasti akan membawa mikroba yang menempel di baju dan celana, rambut dan muka, tangan yang pada akhirnya akan menyebabkan terakumulasinya laboratorium dengan mikroba, karena kondisi laboratorium yang kedap. Bila tidak dilakukan antisipasinya maka laboratorium akan semakin terkontaminasi oleh mikroba dan akan menyebabkan menurunnya persentase kontaminasi kultur jaringan. Oleh sebab itulah maka orang yang masuk ke dalam laboratorium sebaiknya mengenakan tutup rambut, mengenakan baju laboratorium dan mencuci tangannya terlebih dahulu sebelum masuk. Penggunaan baju lab selain menjaga tubuh atau pakaian dari bahan kimia juga menjerap mikroba dan debu yang masih menempel pada pakaian sehingga tidak beterbangan di dalam laboratorium. Demikian pula dengan tutup kepala, sangat efektif untuk menjerap debu dan mikroba yang menempel pada rambut.

3. Menggunakan tutup hidung dan mulut sebaiknya juga perlu dilakukan, karena bila orang yang masuk kie dalamlaboratorium itu sedang sakit flu, maka mikroba dapat tersebar melalui mulut dan hidung ke dalam ruangan. Hal ini dapat diantisipasi dengan tutup hidung dan mulut tersebut.

4. Menserilisasi LAFC (Laminar Air Flow Cabinet) merupakan kegiatan rutin harian yang perlu dilakukan sebelum dan sesudah kerja. Hal ini perlu untuk menjaga agar kondisi laminar selalu dalam kondisi steril. Hal yang perlu dilakukan adalah denganmembersihkan prefilter dari laminar tersebut secara berkala, dan mensterilisasi ruang kerja laminar dengan menyemprotkan alkohol dan menyalakan lampu UV yang ada pada laminar tersebut pada saat tidak digunakan.

5. Mengepel ruang laboratorium merupakan kegiatan harian yang wajib dilakukan untuk menjaga agar kondisi lab selalu dalam kondisi steril. Debbu dan mikroba yang terbawa dan terjatuh di lantai lab di pel dengan bahan desinfektan.

6. mentserilisasi ruangan atau udara dalam laboratorium dapat dilakukan juga setiap hari dengan menggunakan UV atau AC yang dapat membunuh kuman maupun ozonizer dan sebaiknya dalam ruangan tersebut terdapat alat yang berupa filter yang selalu menyaring debu dan mikroba dalam ruangan tersebut.

7. Mensterilisasi rak kultur dan botol kultur perlu dilakukan setiap minggu dengan menggunakan vacum dan menyemprotkan bahan desinfektan (yang mudah menguap) atau mengelap dengan desinfektan lainnya tapi dijaga agar rak dan kultur tidak menjadi basah karena sterilisasi tersebut.

8. Sterilisasi besar dilakukan setiap semesteran atau tahunan dengan tujuan agar laboratorium selalu berada dalam kondisi steril dan tidak terjadi akumulasi debu dan mikroba. Sterilisasi adalah membersihakan semua yang ada di dalam lab tersebut baik ruangan laboratorium maupun alat-alat baik dengan menggunakan formalin maupun yang lainnya.

Bogor, 26 Januari 2012

Edhi Sandra

Sterilisasi Bahan Tanaman Kultur Jaringan

Dalam kultur jaringan inisiasi kultur jaringan bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapangan mengandung debu, kotoran – kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaanya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan , bakteri, serangga dan telurnya, tungau, seta spora – spora. Bila kotaminan ini tidak dihilangkan , maka pada media yang mengandung gula, vitamin, dan mineral, kontaminan, terutama cendawan dan bakteri akan tumbuh secara cepat . dalam bebrapa hari, kontaminan akan memenuhi seluruh botol kultur. Eksplan yang tertutup kontaminan akhirnya mati, dapat sebagai akibat langsung dari serangan cendawan / bakteri atau secara tidak langsung akibat pensenyawaan toxic yang diproduksi cendawan / bakteri .

Pada beberapa jenis tanaman , ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman , terutama bakteri , bakteri- bakteri ini sampai sekarang belum diindentifikasi . kontaminan internal ini sangat sulit diatasi , karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotic atau fungisida yang sistemik.

Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda , tergantung dari :
1) Jenis tanaman nya
2) Bagian tanaman yang dipergunakan .
3) Morfologi permukaan ( misalnya : berbulu atau tidak )
4) Lingkungan tumbuhanya ( green house / lapangan )
5) Musim waktu mengambil ( musim hujan / kemarau )
6) Umur tanaman ( seedling / tanaman dewasa)
7) Kondisi tanaman nya ( sakit / dalam keadaan sehat )

Keadaan ini menyukarakan penentuan suatu prosedur sterilisasi kultur jaringan standard yang berlaku untuk semua tanaman . juga sukar untuk menentukan prosedur standard yang dapat digunakan untuk suatu jenis tanaman yang bersal dari tempat yang berbeda . setiap bahan tanaman harus ditentukan melalui pencobaan pendahuluan.

Dalam sterilisasi bahan tanaman , hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama- sama benda hidup . kotaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman . di Negara Negara tropis biasanya kontaminasi permukaan ini merupakan masalah yang cukup serius . beberapa tahap sterilisasi harus dilakukan.

Bahan sterilisasi ini umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman . pembilasan yang berkali- kali seudah perendaman dalam pelarutan bahan sterilisasi sangat diperlukan untuk menghilangkan sisa- sisa bahan aktif yang masih menempel di permukaan. Dalam sterilisasi kadang- kadang dua atau lebih bahan sterilisasi misalnya : perendaman dalam alcohol dulu, kemudian dalam nitrium hipoklorit dan dibilas. Dapat juga perendaman dimulai larutan fungisida atau antibiotic , kemudian baru merkuri klorid , dan pembilasan dengan air steril . prosedur mana yng paling efektif harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.

Sterilisasi bahan tanamn (misalnya : tunas kentang atau kencur ) dimulai dengan pencucian dan pembuangan bagian – bagian yang kotor dan mati dibawah pancuran air ledeng. Pencucian dapat dilakukan dengan dengan detergent lembut . kadang – kadang bahan yang sudah bersih dibiarkan dibawah pancuran air yang mengalir selama ½-1 jam untuk memecahkan koloni kontaminan permukaan agar koloni – koloni tersebut lebih peka terhadap bahan – bahan sterilisasi .

Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu . ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan . bahan kemudian direndam dalam larutam fungisida dan/ atau antibiotik . setelah waktu perendaman tercapai , bahkan ditiriskan dan dibawa masuk ke dalam laminar air flow cabinet. Prosedur lain dijalankan dalam laminar air flow cabinet. Bahan – bahan tanaman dicelup dulu selama 1 / 2 menit dalam alcohol 70% dan kemudian dimasukkan dalm larutan natrium/ kalsium hipoklorit yang diberi beberapa tetes bahan surfaktan seperti tritone –x , tween 20 atau tween 80 . setelah waktu perendaman dalam larutan natrium / kalsium hipoklorit tercapai, bahan tanaman kemudian dibilas 3 kali dalam aquadest steril selama 10 menit tiap pembilasan . bahan kemudian siap ditanam .

Prosedur ini dapat dimodifikasi misalnya dengan menggunakan :
1) Fungisida / antibiotic – merkuri klorid – bilas aquadest steril
2) Alkohol – sodium hipoklorid – merkuri klorid aquadest steril
3) Alkohol – sodium hipoklorid – petadine – aquadest steril
Dan sebaginya tergantung dari jenis kontaminan dan kepekaan permukaan dari bahan yang dipergunakan . masing – masing peneliti dan laboraturium dapat mengembangkan sendiri cara yang paling efektif untuk keadaan setempat .

Dalam laboraturium yang mempunyai pompa vacum. Sterilisasi dapat dilakukan dalam keadaan vacum dan dikocok dengan meletakkan botol diatas magnetic stirrer hal ini dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi ke dalam larutan juga ditambahkan surfactant beberapa tetes.

Cara Sterilisasi Tanaman (Eksplan) Kultur jaringan

Sebelumnya eksplan kultur jaringan (kuljar) harus dicuci dulu dengan detergen dan dibuang bagian yang tidak perlu. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan lebih dari satu bahan seperti alcohol, bahan pemutih pakaian dan HgCl2. Lamanya proses sterilisasi dan konsentrasi bahan tergantung jenis dan bagian tanaman yang digunakan. Prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi.

Untuk dapat melakukan percobaan sterilisasi kultur jaringan dengan baik, kita bisa membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak.

Untuk meningkatkan efisiensi pensterilisasian pada kultur jaringan dapat menggunakan Tween 20 dengan cara meneteskan 1-2 tetes ke dalam larutan sterilisasi. Tujuannya supaya tegangan permukaan bahan disinfektan menjadi lebih rendah sehingga bahan disinfektan dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga-rongga kecil seperti celah-celah di antara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril.

Semua peralatan dan bahan yang dipakai untuk sterilisasi eksplan kultur jaringan seperti Bunsen, cawan petri, botol kultur yang berisi media, botol bahan disinfektan, botol alkohol 70%, dan alat-alat disiapkan di dalam laminar air flow atau enkas. Setelah semua siap, proses sterilisasi bisa dimulai.

Eksplan kultur jaringan dimasukkan ke dalam larutan disinfektan pertama dengan konsentrasi dan waktu tertentu sambil dikocok-kocok, lalu dibilas dan dimasukkan kedalam larutan disinfektan kedua dan seterusnya hingga semua larutan disinfektan selesai dilakukan. Terakhir, eksplan dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali, tujuannya supaya tidak terdapat sisa-sisa bahan disinfektan yang menempel di eksplan.

Selain sterilisasi dengan kombinasi berbagi bahan disinfektan, bisa juga dilakukan sterilisasi bertingkat (konsentrasi bahan disinfektan semakin rendah) untuk suatu disinfektan yang dibarengi dengan pembukaan setiap daun muda sampai mata tunas telanjang. Untuk kultur anter, anter dapat dipotong dari bunga dan disterilisasi menggunakan klorox (pemutih pakaian) dan HgCl2 dan tidak memerlukan sterilisasi bertingkat.

Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut.

Sterilisasi Ringan, Eksplan kuljar direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dengan air steril tiga kali.

Sterilisasi Sedang, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.

Sterilisasi Keras, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.

Cara Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Jaringan

Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, - Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Media dan Aquades
Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.

Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm. Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan antibiotik: carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.

Enkas
Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan. Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan enkas.

Laminar
Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,

"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.