Prosedur Sterilisasi Untuk Berbagai Macam Organ Tanaman

Jaringan	Sebelum disteril	Sterilisasi	Sesudah disteril	Keterangan
Biji	Dicelup dalam ethanol absolut selama 10 detik dan cuci dalam air destilata yang steril	Biji yg masih lengkap direndam selama 20 –30 menit dalam 10% (w/v) cal hipoklorit atau selama 5menit dalam satu persen w/v cairan air brom	Cuci tiga kali dalam air steril dan kecambahkan dalam air steril. Cuci lima kali dengan air bersih yg steril dan kecambahkan pada kertas filter yang lembab	Jar akar dan tunas untuk pertumbuhan kalus dan sangat baik untuk biji-biji tomat
Buah	Cuci dengan ethanol absolut	Rendam selama 10 menit dlm sodium hipoklorit 2% w/v	Cuci berulang-ulang dengan air steril keluarkan biji atau jar bag dlm	Sumber yang baik untuk mensterilkan seedling
Potongan batang	Gosok sampai bersih pada air ledeng yg mengalir dan cuci dengan ethanol absolut	Celupkan selama 15 – 30 menit dalam sodium hioklorit w/v lepaskan bagian ujung	Cuci tiga kali dalam air steril	Tanam secara vertikal pada medium agar atau lepaskan jaringan dan tanam secara terpisah
Daun	Gosok bagian permukaan dengan ehanol absolut	Rendam selama satu menit dalam merkuriklorid 0,1% w/v	Cuci berulang-ulang dengan air steril. Keringkan denga kertas tisue steril	Bahan yang sulit diteril. Pilih daun yang paling muda. Lamina ditancapkan ke agar atau petiole disisipkan dalam agar

Teknik Kuljar Cara pengambilan eksplan Tanaman Anggrek

Yang dimaksud dengan eksplant di sini yaitu bagian dari bahan tanaman yang sekecil mungkin untuk langsung ditissue-culture kan. Dibawah ini sekaligus diterangkan pula bagaimana cara sterilisasinya, sebelum di tanam.


I Explant diambil dari tunas Dendrobium, MOREL (15).

* Ambil tunas tanaman Dendrobium yang masih lunak, tinggi sekitar 4 – 10.
* Tunas ini kemudian dimasukan ke dalam botol erlenmeyer berisis clorox 10%, satu tetes tween 20, kemudian digojog 10 menit. Sterilisasi dapat juga dikerjakan dengan 0,1% sublimat (HgCl2) di tambah dengan 0,0001% tween 20, KLEIN (11).

* Selanjutnya tunas Dendrobium tersebut di dalam ent-kas diletakan di atas petridish, atau piring petri yang steril. Tunas di telanjangi, artinya dihilangkan dari sarung-sarung daun dan sisik- sisiknya yang menutupi, sehingga tunas-tunasnya kelihatan. Pengambilan explat dikerjakan dengan mengambil bagian yang terujung, yang dinamakan apical meristem, tunas-tunas ketiak, axillary buds, masing-masing sebesar ± 1 – 5 mm³.

* Explant disterilisasi untuk kedua kalinya dengan clorox 5%, satu tetes tween 20 dan digojog selama 5 menit. Explant setelah sterilisasi kedua dicuci dengan aquadest steril. Explant telah siap ditanam.

2. Explant diambil dari tunas Cattleya, MOREL (15), SCULLY (21).
Pada prinsipnya pengambilan tunas dari Cattleya beserta sterilisasinya adalah sama. Tunas yang dipakai sebagai bahan untuk ditissue culturekan adalah tunas baru yang sedang subur-suburnya tumbuh.
LINDEMANN memakai untuk sterilisasi Cattleya 95% alcohol pada permukaan, kemudian pada explant 0,4 – 0,5% dengan kapurit selama 20 – 30 menit.

3. Explant diambil dari tunas Cymbidium,
dikerjakan seperti pengambilan pada tunas Dendrobium atau Cattleya, hanya pengambilan explant dikerjakan dengan cara : tiap mengambil mata tunas-tunas muda diiris melintang, sehingga di dapat bagian-bagian tunas yang cylindris, masing-masing dengan mata. Yang terujung terdapat apical meristem yang merupakan explant yang sangat baik. Sterilisasi dikerjakan dengan cara yang sama. Hanya kadang-kadang kalau bahan lunas dianggap terlalu kotor, dapat direndam terlebih dahulu dalam alcohol absolut sekitar 5 menit, kemudian baru sterilisasi pertama, kedua, dan dicuci aquadest steril.

4. Pengambilan explant dari keiki Dendrobium.
Keiki adalah tunas dari tanaman anggrek yang keluar pada bagian atas dari bulb atau cane. Yang dimaksud dengan cane adalah pseudo-bulb tanaman anggrek juga, yang memanjang, yang bentuknya seperti batang tebu. Batang tebu namanya juga cane.
Setelah keiki diambil, perlakuan sterilisasi, dan pengambilan explant dikerjakan persis sama dengan pengambilan explant pada tunas Dendrobium.

5. Pengambilan explant pada apical meristem Vanda.
Tunas tanaman Vanda yang monopodial ini diambil sepanjang 1 – 2 dm, diukur panjang batangnya saja dari luar. Helaian daun dihilangkan semua sampai dekat batang. Sterilisasi pertama dikerjakan. Kemudian tunas yang masih muda ditelanjangi dari sarung-sarung daunnya. Setelah explant diambil, sterilisasi kedua dijalankan. Selanjutnya explant dicuci dengan aquadest steril, explant telah siap, dapat di tanam.

6. Explant diambil dari tunas mata Cattleya (MOREL).
Waktu yang sebaik-baiknya mengambil mata tunas Cattleya adalah waktu mata mulai tumbuh. Ini berarti bahwa mata mulai membengkak. Untuk keperluan tissue culture, bulb Cattleya yang tunas matanya sedang mulai membengkak dipotong beserta matanya. Bagian atas bulb boleh dipotong dan dibuang. Bagian bulb yang ada matanya ini mengalami sterilisasi pertama. Setelah sterilisasi pertama, tunas mata, dengan ujung pisau atau scalpel yang tajam dan steril di buat irisan persegi empat pada tunas mata yang membengkak tersebut.

Selanjutnya bagian persegi empat yang diiris di atas diangkat, sehingga di dalamnya kelihatan tunas yang sesungguhnya, membulat, lunak. Jadi mata tunas yang sebenarnya terdapat terlindung baik-baik di bawah perisai yang berupa kulit yang diangkat seperti yang diterangkan tersebut di atas. Explant diambil dari tunas mata ini, yang merupakan tunas mata yang berbentuk bola dengan bagian sedikit dari jaringan sekitarnya.

Pengambilan explant dari tunas mata Cattleya.

7. Tunas mata ketiak atau axillary buds pada Vanda
Tunas mata Vanda juga dapat dipakai untuk explant. Caranya : pertama, mata yang diperkirakan sedang tumbuh atau membengkak, dipakai bahan atau kedua, batang Vanda yang masih muda sekali dipakai untuk mengambil explantnya. Setelah itu di kerjakan sterilisasi yang pertama. Sarung-sarung daun dihilangkan, sehingga tunas kelihatan. Tunas mata diambil dengan jaringan yang melingkar di sekitarnya. Sterilisasi kedua dilakukan seperti yang telah di sebut di atas. Explant siap ditissue-culturekan setelah dicuci dengan aquadest steril.

8. Bahan explant yang diambil dari bulb.
Pada Orchis maculata terdapat umbi atau oleh THOMALE disebut bulbus. Bagian-bagian dari umbi yang diiris-iris dapat ditumbuhkan dalam media. Dengan cepat irisan-irisan akan mengeluarkan tunas, THOMALE.

9. Bahan explant yang diambil dari daun
a. Kebanyakan daun yang dipakai untuk explant diambil dari seedlings. Ini lebih mempermudah, karena persoalan sterilisasi sudah hampir tidak ada lagi.
Daun Vanda Sutton X Phalaenopsis yang panjangnya ± 10 mm lebar ± 3 mm setelah ditanam pada media Vacin and Went padat pada pangkal daunnya tumbuh tanaman-tanaman baru.
b. Ujung daun seedlings dipakai untuk explant
CHURCHILL et al, mengambil ujung daun seedlings Cattleya dan Epidendrum untuk bahan tissue culture, dan berhasil menghasilkan tanaman.
c. Ujung daun dari tanaman mudah dipakai untuk explant.
CHURCHILL et al, juga berhasil mengambil ujung daun muda dari tanaman anggrek Laelio-Cattleya ev. Portia Mayflower.


10. Inflorescence sebagai bahan explant.
INTUWONG et al, berhasil mengadakan tissue culture dengan inflorescence bermacam-macam tanaman anggrek, antara lain :
Ascocenda Meda Arnold X Rhynchostylis coelestis
Neofinetia falcata X Rhynchostylis coelestis
Neofinetia falcata X Neofonetia ampullaceum
Semua anggrek dari type Sarcanthine.

Inflorescentia yang masih muda sekali dipotong, kemudian disterilisasi pertama. Bunga-bunganya yang masih muda dan berdesak-desakan dihilangkan dari daun-daun pelindungnya atau bracteola. Setelah disterilisasi yang kedua dan dicuci dengan aquadest steril, kemudian dimasukan dalam media Vacin and Went yang telah dirubah. MOREL menyebutkan keberhasilannya dalam memproduksi protocorm dari tunas mata pada tangkai bunga karangan anggrek Phalaenopsis.


11. explant asal dari ujung akar.
TANAKA (31) berhasil membuat plb kemudian plantlet dari ujung akar. Plantlet yang dimaksudkan di sini adalah tanaman-tanaman kecil yang berasal dari protocorm. TANAKA menggunakan media modified MURASHIGE dan SKOOG, dengan merubah unsur-unsur makro dan mikro menjadi separonya, dan menghilangkan sama sekali hormon auxin dan cytokininnya.
Untuk explant dipilih akar Phalaenopsis yang masih berupa seedlings dalam botol. Ujung-ujung akar dipotong dengan silet steril sepanjang 3 mm. Budaya jaringan dilakukan dalam media padat di dalam tabung reaksi, yang besarnya 18 mm x 180 mm. Temperatur pada incubator 25ºC dan penyinaran lampu dilakukan 16 jam dengan lampu neon putih. Akhirnya dapat dihasilkan plb dan plantlet.

Teknik Kultur jaringan - kultur meristem dan kloning

Kultur Meristem
Dalam kultul jaringan, teknik kultur meristem melibatkan pemotongan bagian puncak tunas yang kemudian dikulturkan dalam suatu media, dan disinilah terjadi defenersiasi dan pertumbuhan sempurna tanaman.

Penyiapan jaringan steril
Tanaman Utuh
• Potong bagian puncak tunas kecambah muda sepanjang 3-5 cm dari tanaman asalnya dengan pisau silet yang tajam.
• Hilangkan semua daun dan bilas dengan sempurna potongan puncak tunas tadi dengan etanol 70%.
• Celupkan dalam larutan natrium hipoklorit 7% atau dalam larutan pemutih 50% selam 5-10 menit. Ke dalam larutan desinfektan ini boleh ditambahkan Tween 20 atau Tween 80 (0,01%) untuk meningkatkan daya pembasahnya.
• Cuci 5-6 kali dengan air suling steril.

Bibit
• Rendam benih dalam air dan buang benih yang mengapung.
• Bilas benih dengan sempurna dalam larutan etanol 70%.
• Rendam benih dalam larutan pemutih 50% menggunakan labu Erlenmeyer 250 ml bertutup, lalu tempatkan pada pengocok selama 15-20 menit.
• Dekantasi, lalu cuci 4-5 kali dengan air suling streil untuk menghilangkan sisa desinfektan.
• Kecambahkan benih secara aseptik diatas 2-3 lapis kertas saring atau kertas penyerap dalam cawan petri. Tambahkan 5ml air suling untuk melembabkan kertas tersebut.
• Tempatkan 5-10 benih pada setiap cawan (tergantung besarnya), dan inkubasikan pada suhu kamar (19-210C). Dua sampai tiga hari setelah perkecambahan, meristem dapat di potong dari ujung tunas.

Pemotongan ujung meristem
• Pemotongan harus dilakukan secara aseptik, sebaiknya dalam lemari aliran udara laminar. Dapat pula dilakukan dalam kondisi semi-steril, karena ujung meristem terlindung dalam banyak gulungan daun dan biasanya bebas dari pencemaran.
• Sterilkan perlengkapan yang digunakan (pisau, jarum dan pinset) dengan merendamnya dalam larutan etanol 70%, bilas dengan air suling dan keringkan dengan kertas saring atau kertas penyerap steril.
• Tindakan ini harus dilakukan setiap saat akan memulai pemotongan dan dilakukan sesering mungkin.
• Bersihkan mikroskop dan tempat pemotongan dengan etanol 70%.
• Peganglah pucuk tunas yang disucihamakan ini dengan pinset pada sebelah tangan di bawah mikroskop dengan pembesaran yang layak (10-50x).
• Hilangkan lapisan daun bagian luar dengan pisau steril yang tajam sampai puncak meristem terlihat. Di bawah mikroskop bagian ini terlihat mengkilat.
• Dengan pisau, buat 4 irisan pada dasar pucuk meristem masing-masing pada sudut yang benar, ambil hati-hati dan tanam segera pada medium agar. Pucuk meristem harus mengandung bagian jaringan prokambium. Daun primordia tidak perlu dihilangkan kecuali jika kultur dimaksudkan untuk menghilangkan virus sistemik.
• Inkubasikan tabung yang berisi meristem dalam lemari pertumbuhan. Sebaiknya lakukan juga uji kondisi pertumbuhan yang lain, misalnya 40 W.m-2 (cahaya lampu pijar), periode terang 16/8 jam pada suhu (beragam) berkisar antara 15-240C.
• Jika cikal terbentuk, biasanya setelah 4-6 minggu, pindahkan dari tabung reaksi, buang medium agar dari sistem akar di bawah air ledeng mengalir dan tanamkan dalam pot yang mengandung vermikulit atau perlit. Tanaman sebaiknya tetap ditutup dengan gelas piala atau kantung plastik sampai tumbuh mapan. Sirami tiapminggu dengan larutan hara Hoagland.

Kloning
• Kloning bisa dilakukan pada media padat maupun media cair.
• Untuk kloning menggunakan media cair, eksplan dimasukan ke dalam media lalu diletakkan ke dalam alat yang bernama shacker, digoyang selama 8-10 minggu
• Pada tanaman anggrek setelah 8-10 minggu, media akan berisi banyak plb (protocorm like bodies)
• Plb tersebut dapat dipindahkan ke dalam media padat

Teknik Kultur Jaringan

Teknik Multiplikasi ( Perbanyakan ) Kultur Jaringan
Dalam teknik kultur jaringan multiplikasi dilakukan untuk perbanyakan pucuk/tunas/klon tanaman dan meningkatkan terjadinya percabangan aksial dan pembentukan pucuk secara adventiv, dengan cara memindahkan tunas-tunas dari dalam wadah kultur secara aseptik yang tumbuh dari hasil induksi dan di tanam lagi dalam botol kultur lain yang berisi media dan hormon yang mampu merangsang pertunasan.

Multiplikasi dilakukan jika ingin mendapatkan eksplan dalam jumlah besar, perangsangan multiplikasi dapat dilakukan dengan cara memodifikasi media tanam baik jenis maupun bentuknya (padat, dan cair), modifikasi hormon (jenis dan konsentrasia).

Cara nya :
• Eksplan dikeluarkan dari botol kultur jaringan lalu dimasukan ke dalam cawan petri.
• Eksplan dipotong-potong (split) dengan menggunakan scalpel dan pinset yang sebelumnya telah digarang.
• Potongan tadi dimasukan ke dalam media multiplikasi (MS0 + (0,5-2mg/l BAP)).

Teknik Pengakaran kultur jaringan
Tujuan nya adalah pembentukan akar dan pembentukan plantlet mandiri hingga menjadi tanaman sempurna dan dapat bertahan hidup sampai dipindahkan dari lingkungan in vitro ke lingkungan luar.

Yaitu dengan cara pemindahan hasil multiplikasi kultur jaringan atau tunas ke media perakaran dengan media yang dapat merangsang pembentukan akar. Perlakuan yang dapat dilakukan dengan memodifikasi hormon perakaran (IBA dan NAA), penggunaan arang aktif, dan memodifikasi lingkungan tumbuh.

Pengakaran dilakukan jika eksplan telah mempunyai organ lengkap seperti daun dan batang. Dapat juga dilakukan jika tujuannya adalah untuk di aklimatisasi maka pengakaran harus dilakukan, tanaman kultur dikeluarkan lalu ditanam kembali ke dalam media kultur baru (pindah media) yang berisi media perakaran (menggunakan arang aktif) pada sub kultur terakhir, biasanya sub kultur ketiga pada tanaman anggrek.

Cara Sterilisasi Tanaman (Eksplan) Kultur jaringan

Sebelumnya eksplan kultur jaringan (kuljar) harus dicuci dulu dengan detergen dan dibuang bagian yang tidak perlu. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan lebih dari satu bahan seperti alcohol, bahan pemutih pakaian dan HgCl2. Lamanya proses sterilisasi dan konsentrasi bahan tergantung jenis dan bagian tanaman yang digunakan. Prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi.

Untuk dapat melakukan percobaan sterilisasi kultur jaringan dengan baik, kita bisa membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak.

Untuk meningkatkan efisiensi pensterilisasian pada kultur jaringan dapat menggunakan Tween 20 dengan cara meneteskan 1-2 tetes ke dalam larutan sterilisasi. Tujuannya supaya tegangan permukaan bahan disinfektan menjadi lebih rendah sehingga bahan disinfektan dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga-rongga kecil seperti celah-celah di antara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril.

Semua peralatan dan bahan yang dipakai untuk sterilisasi eksplan kultur jaringan seperti Bunsen, cawan petri, botol kultur yang berisi media, botol bahan disinfektan, botol alkohol 70%, dan alat-alat disiapkan di dalam laminar air flow atau enkas. Setelah semua siap, proses sterilisasi bisa dimulai.

Eksplan kultur jaringan dimasukkan ke dalam larutan disinfektan pertama dengan konsentrasi dan waktu tertentu sambil dikocok-kocok, lalu dibilas dan dimasukkan kedalam larutan disinfektan kedua dan seterusnya hingga semua larutan disinfektan selesai dilakukan. Terakhir, eksplan dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali, tujuannya supaya tidak terdapat sisa-sisa bahan disinfektan yang menempel di eksplan.

Selain sterilisasi dengan kombinasi berbagi bahan disinfektan, bisa juga dilakukan sterilisasi bertingkat (konsentrasi bahan disinfektan semakin rendah) untuk suatu disinfektan yang dibarengi dengan pembukaan setiap daun muda sampai mata tunas telanjang. Untuk kultur anter, anter dapat dipotong dari bunga dan disterilisasi menggunakan klorox (pemutih pakaian) dan HgCl2 dan tidak memerlukan sterilisasi bertingkat.

Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut.

Sterilisasi Ringan, Eksplan kuljar direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dengan air steril tiga kali.

Sterilisasi Sedang, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.

Sterilisasi Keras, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.

Cara Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Jaringan

Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, - Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Media dan Aquades
Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.

Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm. Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan antibiotik: carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.

Enkas
Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan. Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan enkas.

Laminar
Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,

"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.

Bagaimana perlakuan setelah kultur dalam botol siap tanam?

Perlakuan untuk menyiapkan tanaman dari dalam botol ke luar di sebut aklimatisasi.

"Banyak orang yang kurang mengetahui tentang aklimatisasinya, sehingga kualitas bibit yang dihasilkan menjadi tidak baik, seperti mudah terserang penyakit, pertumbuhan lambat, mudah dehidrasi dan lain lain".

Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses aklimatisasi:

1. Pengurangan perlakuan hormon pada saat akhir-akhir subkultur plantlet. Sehingga kultur dilatih untuk menghasilkan hormon sendiri.
2. Dilakukan proses hardening agar terjadi penyesuaian secara bertahap kondisi lingkungan. Proses hardening adalah meletakkan botol kultur dalam kondisi tertutup rapat di nursery, sehingga kultur mendapatkan fluktuasi sinar dan suhu harian. Hal ini akan merangsang penguatan dinding sel dan melatih metabolisme untuk lebih bekerja keras.
3. Proses pengeluaran kultur dari dalam botol dan ditempatkan pada bak aklimatisasi berupa bak tertutup berlapis agar kondisi lingkungan yang didapat tidak ektrim. Sungkup di buka secara bertahap dengan prinsip bahwa kultur tidak dehidrasi karena angin, suhu atau radiasi sinar.
4. Perubahan kondisi dari dalam botol ke luar sangat berbeda dalam hal kondisi fisik dan ketersediaan bahan makanan bagi tumbuhan. Oleh sebaiknya dibantu dengan makanan yang masih lengkap dalam hal ini bisa diberikan 1/2 MS (Murashige and Skoog) dengan diberi hormon tunas BAP 0,5 mg/l dan NAA 0,3 mg/l.
5. Seringkali terjadi bibit hasil kultur terlihat "njelulur" dan tidak kokoh, maka bisa diberi perlakuan 1/2 MS, packlobutrazol 0,01 mg/l, BAP 0,5 mg/l, NAA 0,3 mg/l , KNO3 1 mg/l.
6. Perlakuan yang diberikan disesuaikan dengan kondisi fisiologis bibit kulturnya.

www.eshaflora.com

Prosedur Kultur Jaringan

Tahapan proses Kultur Jaringan

I. Pengambilan Eksplan
1. Jaringan (Daun, akar, tunas)
2. Biji
3. Meristem
4. Anther



II. Sterilisasi
1. Luar
2. Dalam




III. Penanaman



IV. Sub Kultur
1. Multiplikasi
2. Perakaran
3. Perlakuan




V. Aklimatisasi


www.eshaflora.com