Cara Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Jaringan

Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, - Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Media dan Aquades
Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.

Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm. Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan antibiotik: carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.

Enkas
Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan. Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan enkas.

Laminar
Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,

"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.