MEDIA KULTUR JARINGAN
(ESHA
FLORA X IAAS IPB)
Kultur jaringan merupakan salah satu
metode dalam pembibitan suatu tanaman yang menciptakan hasil steril dan
tentunya hasil yang memuaskan. Kebutuhan dari tanaman itu sendiri terbagi
menjadi 2, yaitu kebutuhan dari lingkungan dan kebutuhan media tanam. Kebutuhan
lingkungan ini termasuk sinar, Karbondioksida (CO2), Oksigen (O2), kelembaban,
sirkulasi udara, dan lain sejenisnya. Sementara itu, kebutuhan media tanam
meliputi fisik tempat tumbuh dan zat kimiawi makanan.
Dalam penyiapan media yang optimal
tentunya juga memerlukan bahan-bahan khusus agar hasil tanaman yang didapat
nantinya dapat tumbuh secara maksimal. Sayangnya, bahan pro analis untuk
pembuatan media tanam ini tergolong cukup mahal, seperti contoh sukrosa untuk
sumber energi tanaman berharga ratusan ribu. Akan tetapi, beruntung bahan-bahan
pro analis ini dapat digantikan oleh bahan teknis/alternatif. Seperti contoh
sukrosa tadi dapat diganti dengan gula pasir putih dengan harga belasan ribu
saja. Tentu hasil yang didapat dari bahan teknis ini juga tidak kalah dari
hasil yang didapat dari bahan pro analis.
Bahan-bahan yang dapat digantikan
ini cukup banyak dari sumber energi untuk tanaman kultur jaringan yaitu sukrosa
dapat digantikan dengan gula pasir putih. Bahan pemadat dari agar bacto dapat
digantikan dengan agar swallow atau agar batangan. Vitamin B1, B6, B12, dan
lainnya dapat digantikan dengan vitamin B Kompleks yang ada di pasaran. Arang
aktif yang dapat diganti norit. Lalu bahkan sampai antibiotik yang biasanya
memakai streptomisin dapat diganti dengan agrept (bakterisida) atau amoksisilin
tablet yang biasanya kita konsumsi saat sakit. Tentunya bahan yang digunakan
harus melalui proses penumbukan dan penyaringan terlebih dahulu agar hasil yang
didapat lebih murni. Ada juga ZPT yaitu zat pengatur tumbuh yang bahan pro
analisnya dapat kita ganti juga dengan bahan teknis/alternatif.
- Proses pembuatan media kultur jaringan
Bahan-bahan :
- Growmore sbg unsur hara
- Vitamin
- Asam amino (glycine, pepton)
- Sumber energi (gula pasir)
- Bahan pemadat (agar-agar
swallow)
- Air steril / akuades
- Myo-Inositol
Alat-alat :
- Pipet plastik
- Pengaduk kaca
- Timbangan digital
- Gelas ukur
- Panci stainless steel
- Alat pengukur pH (kertas
lakmus)
- kompor
Langkah
Kerja :
● Pembuatan Media
- Timbang Growmore (2 gr/L)
menggunakan timbangan digital
- Growmore yang telah ditimbang
dimasukkan ke dalam cerek plastik berisi 500 mL air, kemudian aduk
denganpengaduk kaca
- Campurkan vitamin (5 mg/L) ke
dalam cerek, menggunakan pipet plastik 3 mL
- Campurkan asam amino yakni
glycine ke dalam cerek, sebanyak 2 mg/L dari perbandingan 1:1
- Timbang pepton 100-200 mg/L
atau setara dengan 0,2 g/L, dan larutkan dengan sedikit air sebelum
mencampurkannya ke dalam cerek. Setelah larut, campurkan ke dalam cerek
lalu aduk
- Timbang myo-inositol sebanyak
0,1 g/L, kemudian campurkan ke dalam cerek dan aduk
- Campurkan sumber energi yaitu
gula pasir sebanyak 30 g/L, jika ada tambahan air kelapa maka takaran gula
pasir menjadi 20 g/L. Lalu masukkan ke dalam cerek dan aduk hingga larut
- Tambahkan air ke dalam cerek
hingga genap 1 Liter, lalu aduk kembali.
- Kemudian cek kadar pH larutan
dalam cerek, menggunakan kertas lakmus pH
- Normal pH yang akan dihasilkan
oleh larutan ialah 5.8 hingga 6. Jika larutan terlalu basa maka diturunkan
dengan HCl, dan jika terlalu asam maka dinaikkan dengan NaOH.
- Masukkan zat pemadat yakni
agar-agar yang telah ditimbang sebanyak 6 gr/L, ke dalam panci stainless
steel
- Masukkan juga larutan yang
telah diracik dalam cerek ke dalam panci, lalu aduk.
- Nyalakan api kompor dan masak
larutan media hingga mendidih sambil diaduk terus menerus
- Setelah mendidih, matikan api
kompor
● Sterilisasi Media
Bahan-bahan :
- Larutan media yang telah
selesai dibuat
Alat-alat :
- Beberapa jenis botol
- Plastik PP ukuran 10x10
- Gelang karet
- Autoklaf
- Dendeng
- Kompor
Langkah sterilisasi:
- Siapkan beberapa jenis botol
yang telah disterilisasi selama 1 jam
- Tuang larutan media ke dalam
botol dengan takaran 20 ml/L atau sekitar 2 cm untuk tiap botolnya. Antara
mulut bolot dan cerek usahakan tidak saling bersentuhan karena botol telah
steril.
- Tutup mulut botol dengan
plastik PP dan eratkan dengan gelang karet. Menutup botol tidak boleh
terlalu kencang agar menghindari kerusakan saat botol disterilisasi
kembali pada suhu tinggi (121).
- Botol-botol yang telah terisi
larutan media disusun di dalam dandang untuk disterilisasi
- Siapkan Autoklaf dan isi air hingga batas yang tertera di
dinding autoklaf
- Masukkan dendeng yang berisi
botol-botol media ke dalam autoklaf, lalu tutup rapat penutup autoklaf.
- Pastikan tombol safety pada autoklaf dalam posisi
tertidur dan katup uap dalam posisi berdiri, karena bila katup tertutup,
uap dari proses sterilisasi akan terkurung
- Nyalakan api besar hingga
proses pemanasan pada autoklaf mencapai suhu 121 dengan tekanan 17,5 Psi
- Kecilkan api kompor ketika suhu
telah sesuai dan autoklaf menghasilkan banyak uap, dan diamkan selama 30
menit.
● Proses Pengencangan Tutup untuk
Media
- Mengencangkan tutup plastik di
bagian leher botol menggunakan satu ikatan karet yang sama dengan
sebelumnya, tetapi diikat lagi beberapa kali agar lebih kencang dan rapat
- Menarik plastik agar tidak ada
lagi lekukan atau lipatan, apabila lekukan tersebut tidak dirapikan media
tersebut akan mudah terkontaminasi karena udara akan masuk.
- Mengikat kembali dengan satu
karet hingga kencang apabila plastik sudah rapi.
- Memasukkan botol ke dalam
plastik media berukuran 40 x 60 cm, tetapi sebelum dimasukkan plastik
tersebut disterilkan atau disemprot menggunakan alkohol 30%.
- Menyusun botol kultur (botol
asi) dengan susunan 6 x 8, satu liter dapat menampung 50 botol asi dan 24
botol selai.
- Media sudah siap digunakan
setelah lima hingga tujuh hari ke depan setelah proses sterilisasi dan
pemadatan media. Media tidak dapat digunakan langsung karena belum bisa
melihat kontaminasi dari bakteri ataupun jamur sebab media yang
terkontaminasi tidak dapat digunakan.
B. Pencucian dan
Sterilisasi botol
Alat :
- Wadah plastik berukuran sedang
- Botol kultur habis pakai atau
media yang telah terkontaminasi
- Sikat
Bahan :
- Air
- Detergen
- Bayclin
Langkah Kerja :
- Membersihkan botol dari media
tanam yang terkontaminasi oleh mikroorganisme atau telah digunakan untuk
proses pengkulturan.
- Menuangkan satu tutup botol
bayclin ke dalam wadah yang berisikan air.
- Menuangkan detergen secukupnya
ke dalam wadah yang berisikan air dan bayclin hingga berbusa.
- Merendam botol-botol kultur
yang telah dibersihkan dari media tanam selama 30 menit hingga 1 jam .
- Menyikat bagian dasar dan sisi
botol setelah 1 jam perendaman, hal ini dilakukan agar sisa-sisa media
tanam yang terkontaminasi di dalam botol dapat dibersihkan dengan
maksimal.
- Membersihkan bagian sisi luar
botol menggunakan spons atau kain untuk cuci gelas atau piring.
- Botol yang telah disikat dan
dibersihkan bagian luarnya kemudian dibilas di air mengalir hingga
bersih.
- Botol yang sudah dicuci
kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf selama 1 jam dengan
suhu 121 .