Subkultur dalam Kultur Jaringan Tanaman

SUBKULTUR DALAM KULTUR JARINGAN TANAMAN

Ir. Edhi Sandra MSi.      1)

Ir Hapsiati                       2)

Azizah Zahra S Hut      3)

1). Dosen Konservasi Keanekaragaman Tumbuhan DKSHEFahutan IPBUniversity

Kepala unit Kultur Jraingan Divisi DKKKSHEFahutan IPBUniversity

Kepala BioteknologiLingkungan PPLHLPPMIPB University

Kepala SUA Konervasi IPB University

Pendiri Esha Flora, Plant And Tissue Culture

2). Pemilik dan Pendiri Esha Flora, Plant And Tissue Culture

3) Pemilik dan Manajer Humas dan Promosi

Pendahuluan

Pengertian subkultur dalam hal ini adalah pemindahan kultur dari botol kultur yang satu ke botol kultur lainnya, dengan berbagai tujuan. Oleh sebab itulah maka dalam mengerjakan subkultur kita harus mengetahui tujuannya terlebih dahulu dan menyiapkan semua kebutuhan untuk subkultur tersebut. Hal ini sangat penting untuk meningkatkan persentase keberhasilan di dalam subkultur

Banyak hal-hal sederhana dalam subkultur jaringan tanaman yang perlu diperhatikan yang seringkali lepas dari evaluasi, atau lupa terfikirkan, sehingga pada akhirnya berdampak pada hasil yang kurang baik, hasil yang kurang optimal bahkan seringkali menyebabkan kerugian dan kegagalan.

Banyak persepsi dan pemahaman yang keliru terkait pertumbuhan eksplan dan subkultur sehingga laboran atau praktisi melakukan kegiatan kultur jaringan yang salah, sehingga lambat laun kultur berangsur mati. Membenarkan persepsi dan pemahaman yang salah ini sangat penting agar kita dapat memberikan perlakuan antisipasi yang benar dan dapat meningkatkan peluang tumbuhnya eksplan.

Persentase Keberhasilan

Di Esha Flora persentase keberhasilan subkultur secara umum adalah kisaran 80 % - 100 %. Sedangkan persentase keberhasilan inisiasi pada kisaran 0% - 10 % saja. Hal ini bisa dipahami bahwa untuk inisiasi, bahan eksplan belum steril, apalagi bahan eksplan yang berasal dari alam, dari hutan, maka bisa dipastikan di dalam eksplan tersebut terdapat mikroba indofet, mikroba yang ada di dalam eksplan tersebut, hal inilah yang menyebabkan eksplan seringkali kontaminasi setelah diinisiasi beberapa waktu.

Berbeda dengan inisiasi maka subkultur, pada umumnya kondisi sudah steril sehingga peluang keberhasilan sangat tinggi. Tapi banyak juga kemungkinan kultur tanaman yang sebenarnya masih mengandung mikroba di dalam jaringannya, mikroba tersebut belum sempat keluar saat inisiasi awal, dan sudah pulih atau sembuh lukanya sehingga mikroba tidak dapat keluar dan mengkontaminasi media. Tapi saat disubkultur, bahan subkultur dipotong-potong dan luka akhirnya mikroba yang masih ada di dalam kultur tanaman akan keluar dan mengkontaminasi media kultur.

Persiapan subkultur

Persiapan yang perlu dilakukan dalam merencanakan subkultur adalah mengindentifikasi keperluan apa saja yang diperlukan sesuai tujuan subkultur yang akan dilakukan dan menyiapkan semua perlengkapan yang diperlukan. Terutama sekali di dalam menyiapkan perlengkapan untuk subkultur adalah ketersedian media kultur steril yang sesuai dengan keperluannya, dan biasanya di dalam melakukan subkultur kita perlu menyedikan beberapa formula media kultur steril untuk mengantisipasi ragam bentuk sediaan kultur yang ada yang perlu di subkultur ke media yang sesuai.

Kapan Subkultur Harus Dilakukan

Pertanyaan ini seringkali muncul dan ditanyakan, hal ini berarti bahwa yang menanyakan tersebut belum memahami maksud dan tujuan subkultur serta karakteristik situasi kondisi kultur tanamannya. Tidak ada keharusan bahwa subkultur itu harus setelah sekian bulan dan sebagainya, tapi hal ini disesuaikan dengan tujuan dan kondisi kultur tanamannya.

Ragam Tujuan Subkultur

Subkultur tidak hanya sekedar untuk memperbanyak saja. Sama halnya dengan kultur jaringan bukan hanya sekedar teknologi untuk perbanyakan saja tapi masih banyak pula tujuan dari kultur jaringan. Saya membagi tujuan subkultur seperti dijelaskan dibawah ini.

1.       Penyelamatan

2.       Perbanyakan

3.       Peremajaan

4.       Penjarangan

5.       Perlakuan

6.       Pemilahan

1.Penyelamatan adalah subkultur yang dilakukan dengan tujuan untuk menyelamatkan eksplan yang terkontaminasi. Bila yang terkontaminasi adalah di media dan tidak menempel pada eksplan maka dalam subkulturnya bisa langsung di pindahkan ke media kultur steril yang baru, tanpa harus diproses sterilisasi lagi. Tapi bila kontaminasi menempel pada eksplan, maka eksplan diproses sterilisasi seperti awal inisisi lagi. Penyelamatan juga bisa dilakukan pada eksplan yang mengalami browning yang berat, sehingga media di sekitar eksplan sudah mencoklat pekat, dalam hal ini akan menghalangi penyerapan bahan makanan dari media ke eskplan. Penyelamatan juga bisa dilakukan bila :

a. Ekplan mengalami sebagian kematian, tinggal titik tumbuh yang sudah mulai menumbuhkan tunas baru tapi batang bawah yang ke media kultur mengalami kematian atau sakit, sehingga harus cepat diselamatkan untuk diambil mata tunasnya saja yang sudah menumbuhkan tunas untuk di tanam di media baru.

b. Eksplan/ kultur tanaman secara tidak sengaja lepas dari media karena botol di bolak-balik saat di lihat oleh orang.  Berarti bahwa eksplan/kultur tanaman yang lepas tersebut sudah tidak kontak dengn baik lagi dengan media hal ini akan kurang baik bagi pertumbuhan eksplan/kultur tanaman. Oleh sebab itulah perlu di subkultur untuk ditanam atau di benamkan sedikit ke media agar kontak dengan media bagus sehingga proses penyerapan makanan dapat terjadi dengan baik.

2.Perbanyakan adalah subkultur dengan tujuan agar kultur dapat cepat bermultiplikasi. Semakin cepat waktu subkultur yang dilakukan akan semakin cepat hasil perbanyakan subkulturnya. Subkultur untuk tujuan perbanyakan bisa terdiri dari : perbanyakan stek mata tunas, perbanyakan embrio somatik, perbanyakan kalus, perbanyakan jaringan. Dalam hal ini masing-masing memerlukan formula media yang berbeda-beda.

3.Peremajaan adalah subkultur yang bertujuan untuk meremajakan sifat kultur tanaman yang akan dihasilkan. Dalam hal ini biasanya subkultur dilakukan pada kultur tanaman yang sudah tua yang sudah kehabisan bahan makanan dari media kulturnya, dan kultur tanaman sudah terlalu tua.

4.Penjarangan adalah subkultur yang bertujuan untuk mengurangi jumlah individu dalam suatu populasi kultur akibat dari pertumbuhan sehingga populasi terlihat berjejal padat, hal ini akan kurang baik bila di diamkan karena akan bersaing kebutuhan faktor pertumbuhan.  Hal ini biasanya dilakukan pada kultur biji anggrek. Kultur semai biji anggrek biasanya dijarangkan sampai 3-4 kali subkultur agar pertumbuhan individu dapat tumbuh dengan baik.

5.Perlakuan adalah subkultur ke media kultur steril baru yang sudah diberi perlakuan tertentu. Subkultur untuk keperluan perlakuan biasanya terkait dengan kesamaan bahan kultur awal sebagai bahan eksplan yang seragam untuk perlakuan penelitian sehingga dapat dianalisa perbedaan pertumbuhan dari perlakuan yang diberikan. Subkultur untuk keperluan perlakuan terdiri dari dua macam, yang pertama diberi perlakuan dan langsung dilihat bagaimana pertumbuhan kultur tersebut di media perlakuan tersebut. Kedua, adalah subkultur ke media perlakuan untuk waktu tertentu, setelah kultur terpapar/ terkena/ terpengaruh oleh perlakuan, maka kultur harus segera dipindahkan ke media pertumbuhan normal. Biasanya dalam hal ini disebabkan bahwa media perlakuan bersifat menghambat dan akan dapat mematikan ekplan atau kultur bila tidak dipindahkan ke media normal kembali. Contoh dalam hal ini adalah pemberian perlakuan kolkisin pada media kultur untuk tujuan poliploid. Eksplan di masukkan ke media perlakuan kolkisin sekitar 2 – 3 bulan untuk kemudian dipindahkan kembali ke media pertumbuhan normal.

6.Pemilahan adalah subkultur yang dilakukan dengan mengambil bagian kultur tanaman tertentu sesuai dengan karakter bagian kultur tanaman dan harus seragam pengambilan bagian kultur tersebut agar hasil subkultur dari bagian kultur tanaman tersebut bersifat seragam dengan karakter/sifat yang diinginkan. Misalnya untuk mendapatkan hasil bibit kultur jaringan yang memiliki kualitas pembungaan dan pembuahan yang baik, cepat berbunga dan berbuah, pertumbuhan baik, masih muda tapi sudah berbunga dan berbuah dan viabilitas bagus, maka dalam hal ini bagian kultur yang kita ambil adalah tunas mudanya saja atau pucuk-pucuknya saja yang diambil dari kultur yang sudah berumur di atas 6 bulan. Dan sebaliknya untuk menghasilkan kultur dengan metabolit sekunder yang tinggi maka yang diambila pada saat subkultur adalah, bagian pangkal dari kultur yang berasal dari botol kultur yang umurnya sudah diatas 6 bulan bahkan lebih dari satu tahun misalnya, maka kultur yang akan dihasilkan seragam dengan kemampuan menghasilkanmetabolit sekunder yang tinggi.

SubkulturYang Efisien Dan Efektif

Pada saat kita mensubkultur suatu kultur tanaman tertentu, maka sebenarnya dalam satu botol kultur akan terjadi beberapa bentuk morfologi pertumbuhan yang terjadi pada kultur tanaman yang ada dalam satu botol kultur tersebut. Misalnya kita mau mensubkultur tanaman untuk persiapan aklimatisasi, maka suda mulai kita seleksi dan siapkan kultur tanaman yang sudah tinggi/panjang untuk di bentuk kearah individu tunggal, atau masuk ke fase perakaran misalnya. Jadi bagian kultur tanaman yang batangnya sudah agak  tinggi di subkultur dan dimasukkan ke bagian perakaran dan pemanjangan individu. Tapi dalam botol kultur tersebut, tidak semua bentuk kultur tanaman berupa batang pucuk yang sudah mulai memanjang, tapi bisa pula dalam bentuk misalnya embrio somatik, atau mungkin ada kalus. Lalu apakah bentukan kultur ini dibuang atau dibiarkan, tentunya sekalian disubkultur tapi sesuai dengan bentukan morfologinya untuk yang embrio somatik di masukkan dalam media embrio somatik, dan yang kalus dimasukkan ke media kalus dst.

Dengan demikian semua bahan kultur tanaman steril tidak ada yang terbuang semua bisa disubkultur sesuai dengan kondisinya. Berarti bahwa di dalam kita mensubkultur maka kita harus menyiapkan berbagai formula media yang mungkin akan kita temui, walau misalnya tujuan subkultur adalah untuk perakaran, misalnya.

Variasi Somaklonal Hasil Subkultur

Bila kita tidak melakukan pemilahan di dalam melakukan subkultur berulang, atau kita mensubkultur semua bahan kultur yang ada maka sebenarnya bibit hasil subkultur berulang yang tanpa dilakukannya pemilahan akan mengalami variasi somaklonal yang disebabkan oleh adanya variasi umur  dan fisiologi. bila secara garis besar umur di bagi menjadi 2 kelompok besar yaitu muda dan tua. Dan untuk yang fisiologis juga dibagi 2 kelompok yaitu remaja (jouvenil) dan dewasa (mampu bereproduksi), maka hasil cloning yang di dapat ada variasi:

1.Muda – Remaja                 : adalah karakter seperti karakter biji, umur panjang, lama berbunga, pertumbuhan  tinggi. Karakter ini sangat bagus untuk jenis-jenis pohon yang dipanen batangnya.

Pemilahan                               : ambil pucuk-pucuknya saja dari kultur yang umurnya belum lebih dari 6 bulan.

2.Muda – Dewasa                 : masih muda, baru tumbuh tapi sudah bisa menghasilkan bunga dan buah hal ini sangat bagus untuk tanaman buah dan bunga

Pemilahan                               : ambil pucuk-pucuknya saja dari kultur yang umurnya lebih dari 6 bulan atau lebih.

3.Tua    -  Remaja                  :  umur tua lambat, kerdil, tidak berbunga dan berbuah, karakter ini sangat cocok untuk bonsai, atau tanaman yang ingin dikerdilkan tapi juga tidak memerlukan bunga dan buahnya

Pemilahan                               : ambil bagian pangkal dari kultur yang umurnya masih atau kurang dari 6 bulan.

4.Tua    -  Dewasa                     :  umur tua, kerdil, pertumnbuhan lambat tapi berbunga dan berbuah, sangat baik untuk tanaman buah hutan tropis yang umurnya panjang dan berbunga dan berbuahnya lama, seperti matoa, kecapi, duku dll, pemilahan ini juga bagus untuk mendapatkan kultur dengan tujuan metabolisme sekunder

Pemilahan                                  : ambil bagian pangkal kultur yang umur kulturnya sudah lebih dari 6 bulan atau lebih.

Subkultur Dan Kualitas Kultur

Faktor subkultur yang mempengaruhi kualitas kultur adalah :

1.       Pemilahan di dalam subkultur sangat menentukan keseragaman cloning bibit yang dihasilkan. Bila di dalam subkultur tidak dilakukan pemilahan bagian ekspan yang diambils esuai dengan tujuannya maka di dalam bibit yang dihasilkan terdapat 4 ragam variasi bibit kultur yang dihasilkan.

2.       Jumlah subkultur yang berulang kali menentukan kualitas bibit kultur yang dihasilkan. Tapi mengenai hal ini bukan berarti bahwa permasalahan ini tidak dapat diatasi dan kita harus selalu mengambil bahan eksplan baru agar kualitas sama seperti awal, padahal tidak harus seperti itu, kita bisa tetap mengambil eksplan dari bahan kultur yang ada hanya perlu tau apa saja yang perlu diperhatikan.

3.       Waktu inkubasi menentukan jumlah perbanyakan bibit yang dihasilkan dalam satu kali subkultur. Semakin cepat subkultur dilakukan akan semakin banyak jumlah hasil perbanyakan subkulturnya

4.       Ukuran ekspan yang diambil dan disubkultur menentukan konsekuensi keberhasilan terkait dengan kontaminasi dan viabilitasnya.

5.       Subkultur kalus sebaiknya tidak lebih dari 3 bulan, bahkan sebaiknya di bawah 1 bulan dan yang diambil adalah bagian yang sel-selnya baru tumbuh, syukur-syukur bila ada embrio somatiknya maka ambil embrio somatik yang paling ujung/ tumbuh terakhir

6.       Subkultur untuk jenis pohon yang sangat lambat tumbuhnya juga jangan menunggu agar eksplan tum buh tinggi baru kemudian di subkultur tapi usahakan subkultur tidak lebih dari 1 bulan, maksudnya menjaga agar bahan eksplan selalu dalam kondisi jouvenil, baik sel atau jaringannya yang memang jouvenil, juga tidak terimbas metabolit sekunder kearah kematian (zat penghambat, dan etilen) fisiologi tua dari kultur yang umurnya sudah tua.

7.       Semakin kecil ukuran bahan eksplan yang digunakan saat subkultur akan semakin kecil dampak fisiologis dan morfologi tua (metabolit sekunder kearah kematian) dari bahan kultur indukannya. Sebagai gambaran bahan eksplan apikal yang diambil sekitar dibawah 0,5 cm

Bagaimana caranya agar jumlah banyaknya subkultur tidak mempengaruhi kualitas?

Banyak pihak yang menyampaikan bahwa subkultur tidak boleh lebih dari 6 kali, yang lain bilang tidak boleh lebih 4 kali. Setelah itu maka mereka akan melakukan inisiasi lagi dari awal. Apakah memang demikian? Apakah tidak bisa kita lakukan subkultur terus menerus dengan kualitas yang sama seperti awalnya?

Untuk dapat menjawab pertanyaan tersebut maka prinsipnya adalah sebagai berikut:

1.       Ingatlah selalu prinsip Totipotensi yaitu seiap sel tumbuhan mengandung rangkaian genetik yang lengkap, jadi satu sel tersebut cukup untuk dapat menjadi individu baru yang sama dengan induknya. Dan setiap sel tersebut mengandung rangkaian gen yang lengkap dan sama untuk semua sel vegetative dari individu tersebut.

2.       Kondisi fisiologi suatu mahluk hidup ditentukan oleh fisiologi dari sel-sel atau jaringan yang membentuk individu tersebut. Oleh sebab itulah bila individu tersebut didominasi sel-sel yang masih muda maka dominasi sel-sel muda tersebut akan mendominasi sifat fisiologi dari individu tersebut. Demikian pula sebaliknya bila suatu individu didominasi oleh sel-sel yang sudah dewasa maka individu akan didominasivoleh sifat-sifat dewasa.

3.       Disisi lain yang perlu juga diingat bawa, misalnya suatu individu di dominasi oleh sel-sel yang sudah dewasa, tapi bukan berarti bahwa di dalam individu tersebut tidak ada sel-sel yang muda, demikian pula dengan sel-sel yang tua. Jadi sebenarnya di dalam suatu individu terdapat ragam sel-sel yang berbeda sifat dan karakter fisiologinya tergantung pada umur dan morfologi sel.

4.       Dan walaupun di dalam individu terdapat variasi dan ragam fisiologi morfologi sel akan tetapi semua sel vegetative mempunyai gen yang sama dari individu tersebut. Gen tersebut tetap tapi ekspresi yang muncul dari suatu sel dipengaruhi oleh sifat dan karakter fisiologis dari sel tersebut. Oleh sebab itulah bahwa karakter suatu sel atau eksplan atau kultur belum tetntu disebabkan oleh perubahan genetic (mutasi), tapi juga dimungkinkan oleh sifat fisiologis morfologis dari sel tersebut.  Dan ekspresi yang muncul tersbut bisa di kembalikan ke sifat dan karakter gen awal bila sifat dan karakter sel tidak mempengaruhinya.

5.       Cara untuk mengembalikan sifat dan karakter murni gen suatu mahluk hidup bisa dilakukan dengan cara kita berusaha mengisolasi gen dalam suatu sel yang sifat dan karakter selnya belum terekspresikan dan akan berdampak mempengaruhi karakter gennya. Untuk itu bisa dilakukan dengan Metode Kultur Meristem. Dalam teknologi kultur meristem, bahan eksplan yang diambil tidak boleh lebih besar dari 0,5 mm, jadi benar-benar yang diambil dalam hal ini adalah sel meristem yang baru membelah dan belum terekspresikan, dan belum terkontaminasi penyakit maupun virus.

Berdasarkan pemahaman prinsip diatas maka kita dapat mensubkultur tanpa batas tanpa harus merubah karakter gennya. Oleh sebab itulah maka Program Esha Flora dalam merintis koleksi keanekargaman hayati plasma nutfah Indonesia secara ilmiah sangat di mungkinkan. Kita dapat mengkoleksi specimen hidup dengan cara di tidurkan (Metode Pertumbuhan Minimal), dan bila diperlukan akan dibangunkan dan diperbanyak dan dioptimalkan karakter gennya (Metode Kultur Meristem), bahkan dapat kita muliakan dengan berbagai metode (poliploid, kultur anther, kultur mutasi dll), bahkan dapat kita produksi bahan bioaktif langsung dari dalam botol seperti Metode metabolit sekunder.

Jadi agar subkultur tidak merubah sifat dan karakter eskpresi individu maka dalam melakukan subkultur seharusnya menggunakan metode meristem, tapi bila sulit dan tidak dimungkinkan maka yang dapat dilakukan adalah :

1.       Lakukan subkultur tidak lebih dari 1 bulan, maksudnya adalah agar umur sel di dalam kultur masih masuk dalam kategori muda, dan sampai 3 kali subkultur masih masuk dalam kategiri muda. Berdasar pengalaman, suatu sel akan mengalami sifat tua bila umur sudah lebih dari 4 -6 bulan, maka karakter sel berubah menjadi dewasa dan terus berlanjut ke tua sejalan dengan bertambahnya waktu.

2.       Dalam mengambil bahan eklsplan dari kultur yang umurnya tidak lebih dari satu bulan tersebut , maka eksplan yang diambil adalah tunas apikalnya saja atau boleh dengan satu tunas lateralnya, jadi dua titik tumbuh dari ujung. Maksudnya adalah bahwa umur eksplan yang diambil diharapkan tidak lebih dari 2 minggu.

3.       Bila terlihat terjadi penurunan sifat atau kualitas pertumbuhan maka untuk selanjutnya maka bahan eksplan yang diambil adalah tunas apikalnya saja dan yang diambil usahakan sekecil mungkin, seperti kita mengambil kultur meristem. Hal ini akan membuang berbagai sifat dan karakter sel yang lambat laun terimbas tua dengan dilakukannya subkultur berulang, setelah dilakukan pengambilan seperti ini maka diharapkan karakter kultur yang dihasilkan hampir sama dengan kultur meristem. Dan dapat terus dilakukan subkultur.

Subkultur Jenis Pohon

Subkultur pohon kita jangan sampai terjebak dengan pertumbuhan eksplan yang lambat sehingga seksplan terlihat masih kecil di dalam botol kultur. Tidak adanya pertumbuhan eksplan atau tumbuhnya yang sangat lambat membuat ekplan bertambah sekitar 1 daun satu bulan sehingga dalam waktu 4 bulan masih dalam bentuk kultur yang batang tunggal dengan sekitar 4 daun. Hal menyebabkan botol kultur terlihat masih leluasa. Dari sudut pandang media, memang media tersebut masih memungkinkan untuk di pakai tumbuh oleh kultur pohon tersebut, tapi kalau kultur tersebut dibiarkan dulu sampai terlihat agak panjang, maka dalam persepsi kita tidak akan terlalu rugi karena media masih bisa dipakai tapi hasil subkultur hanya dapat di potong-potong menjadi 4 eksplan saja.

Padahal yang harus diingat bahwa semakin lama kita menunda subkultur maka berarti di dalam botol kultur tersebut ada sel yang umurnya lebih dari 4 bulan, bila jumlah sel yang umurnya lebih dari 4 bulan mendominasi sel-sel dari kultur tersebut maka kultur tersebut akan mengeluarkan metabolit sekunder kearah kematian (zat etilen dan zat penghambat), sehingga sel-sel mudanya pun akan terimbas fisiologis tua atau sifat kearah kematian, maka lambat laun kutlur akan semakin lambat tumbuhnya dan lambat laun mati.

Untuk menjaga tingkat viablitas atau jouvenilitas sel eksplan pohon maka yang dijadikan acuan adalah waktu subkultur, usahakan tidak mensubkultur lebih dari 1-2 bulan agar umur sel sampai disubkultur kembali tidak lebih dari 2 bulan, hal ini akan menjaga agar umur sel tetap muda, dan sifat sel masih bersifat jouvenil. Dan usahakan ambil pucuk apikalnya saja, sedangkan bila kita mengambil mata tunas dibagian bawahnya maka umur sel atau jaringan tersebut tidak lebih dari 3 bulan. Bila kita melakukan ini (mejaga agar sifat dan karakter kultur tetap jouvenil, maka subkultur dapat terus dilakukan.

Subkultur kalus

Dalam mensubkultur kalus maka yang perlu diperhatikan saat kita mensubkultur usahakan yang kita ambil untuk disubkultur hanyalah sel-sel yang baru tumbuh saja, kalaupun kita mengambil bagian kalus yang sudah ada sebelumnya maka total umur sel kalus tersebut jangan lebih dari 4 bulan. Jangan terperangkap pada  “Media kultur masih leluasa untuk pertumbuhan kalus”, tapi kalau memang umurnya sudah lebih dari 1 – 2 bulan harus cepat di subkultur jangan menunggu sampai 4 bulan. Umur kalus adalah umur sel, bukan umur individunya sehingga secara fisiologi dia akan lebih cepat tua.

Disatu sisi untuk memperbanyak dan menjaga jouvenilitas maka diharapkan kalus dapat membelah lebih cepat dan lebih banyak. Padahal membelah lebih cepat dan lebih banyak maka halini masuk dalam kategori ”pertumbuhan vegetative” hal ini bertolak belakang dengan tujuan terbentuknya embrio somatik, yang secara fisiologis seharusnya pertumbuhan vegetatif melambat dan prioritas akan beralih ke pertumbuhan embrio somatik. Oleh sebab itulah maka biasanya diberi zat penghambat. Zat yang berfungsi sebagai zat penghambat dari hormon tunas adalah auksin, maka dapat digunakan hormon 2,4D, atau bisa juga digunakan pickloram. Kalus menghambat pertumbuhan organ. Pertumbuhan kalus akan sangat baik dalam pembentukan embrio somatik, tapi pertumbuhan kalus yang tinggi justru menghambat pertumbuhan embrio somatik. Oleh sebab itulah maka pertumbuhan yang tinggi yang awalnya dipakai untuk pembelahan kalus diganti kearah pertumbuhan embrio somatik, maka pertumbuhan yang tinggi, daya hambat kearah pembelahan kalus, dorongan yang kuat kearah tunas, kesemua hal tersebut akan menyebabkan pertumbuhan embrio somatik.

Subkultur Tanaman Variegata

Subkultur tanaman variegata akan menghasilkan kultur varigata yang permanen bila, tanaman induk yang diambil eksplannya memiliki variegata yang stabil. Variegata yang stabil adalah variegata yang terjadi di meristem apikal sehingga setiap sel, jaringan dan organ yang baru tumbuh mengalami variegata. Jadi bila tanaman induk memiliki variegata yang stabil dari meristem apikalnya, maka bila kita mengambil eksplan dari kultur meristem apikalnya maka semua kultur yang dihasilkan akan stabil.

Bila suatu tanaman variegatanya tidak stabil, kadang muncul variegata kadang tidak maka kita harus cari variegata yang berasal dari meristem dan bersifat stabil maka diharapkan semua kultur dari meristem yang variegata akan bersifat stabil.

Variegata yang tidak stabil bisa dibuat stabil dengan cara mengambil eksplan dari  bagian tanaman yang variegata, eksplan yang berasal dari sel atau jaringan yang variegata dikulturkan kemudian dengan metode embrio somatik ditumbuhkan tunas-tunasnya dan dibuat plantlet, sambil di seleksi planlet yang stabil variegatanya dengan melihat variegata di setiap daunnya berarti sel atau jaringan yang tumbuh dari meristem tersebut bersifat stabil.

Kultur eksplan variegata dengan menggunakan metode embrio somatik, maka sebenarnya setiap sel dari sel embrio somatik bersifat individual, dan tergantung pada setiap selnya kemungkinan mempunyai tingkat variegata yang berbeda. Jadi walaupun bagian eksplan yang diambil adalah variegate, tapi kemudian yang tumbuh saat proses embrio somatik dan menjadi tunas adalah sel yang tidak termutasi dan tidak variegata maka kultur yang tumbuh dari sel tersebut akan kembali normal.

Subkultur untuk memunculkan variasi mutasi dan variegata

Bahan eksplan tanaman steril yang berupa kalus atau embrio somatic, bila di beri perlakuan induksi mutasi dan variegate pada media kulturnya, kemudian di tambah dengan pemberian perlakuan sinar gamma, maka sebenarnya setiap sel atau embrio somatic berpeluang mengalami mutasi yang eragam, oleh sebab itulah untuk membangkitkan variasi ragam mutasi dan variegate yang ada maka subkultur yang dilakukan adalah dengan mensubkultur sebanyak mungkin eksplan dari sel-sel yang diberi perlakuan, sampai jumlah hasl subkultur bahan kultur yang telah diberi perlakuan menjadi sangat banyak hal ini berpeluang untuk memunculkan variasi mutasi dan variegate, karena setiap sel dari kultur yang diberi perlakuan akan mengalami mutasi atau vairgata, dan jumlah sel dari kultur kalus atau embrio somatic yang diberi perlakuan sebenarnya jumlahnya adalah ribuan, maka sebenarnya akan terdapat ribuan variasi miutasi dan variegate, bila sel tersebut bisa muncul dan terekspresikan setelah membentuk menbrio somatic dan menjadi tunas serta menjadi individu baru.

Oleh sebab itulah maka sebenranya perlakuan ini layak untuk diusahakan karena peluang untuk mendapatkan mutasi dan variegate sangat besar,s edangkan selama ini ,mendapatkan mutasi dan variegate secara alami sangat sulit, 1 berbanding 1 juta kalinya. Wajar bila kita harys bersabar untuk melakukan ini sekitar 2-3 tahun untuk sampai dapat melihat variegate yang stabil dan variegatanya spektakuler keren/cantik baru kemudian dapat diperbanyak jumlah besar, tapi dalam pemasaranya diatur agar tidak terjadi booming atau Over suplai.

Bogor, Senin 19 Agustus 2019, jam 20.28.